摘要：本研究以我國首例非洲豬瘟疫情中分離的流行毒株(SY18)為親本株構(gòu)建了多基因家族(MGF)基因和CD2v基因缺失的非洲豬瘟病毒基因缺失疫苗候選株，針對基因缺失株的安全性和免疫保護(hù)效果進(jìn)行了特性研究。結(jié)果顯示，MGF和CD2v雙基因缺失株對豬安全，接種豬能夠100%抵抗親本毒株SY18株的攻擊，對照豬全部死亡。

來源：中國獸醫(yī)學(xué)報(bào)

迄今，國際上采用基因工程手段獲得了多個(gè)ASFV基因缺失疫苗候選株，以及通過細(xì)胞傳代致弱和從自然界分離弱毒株的方法獲得了弱毒疫苗候選株，其中一些疫苗候選株在研究報(bào)道中針對同源病毒株攻擊有50%~100%保護(hù)率，但對異源病毒的攻擊保護(hù)效果不甚理想。此外，無論是人工基因缺失弱毒株還是自然缺失弱毒株，豬免疫后出現(xiàn)劑量依賴性副反應(yīng)，免疫豬出現(xiàn)精神沉郁，食欲降低，發(fā)熱、病毒血癥、高丙球蛋白血癥、肺炎、關(guān)節(jié)腫脹、跛行、慢性病變和僵豬等，降低了疫苗的實(shí)際使用價(jià)值。人工基因缺失株盡管具有很好的免疫標(biāo)記，但基因缺失疫苗的有關(guān)報(bào)道不多。目前人們普遍關(guān)心的是非洲豬瘟基因缺失株和自然弱毒株作為疫苗的安全性問題。我國現(xiàn)有國情決定了我國現(xiàn)階段應(yīng)走疫苗免疫防控路線。

ASFV擁有超大基因組，長160~ 190 kb，編碼160多種蛋白，其中50多種為結(jié)構(gòu)蛋白。病毒編碼的蛋白成分中，很多具有免疫抑制特性，但目前通過與自然弱毒株基因組序列的比較和分析等方法確認(rèn)的與免疫抑制有關(guān)的基因只有少數(shù)幾種，包括CD2v、MGF、9GL等。在已經(jīng)報(bào)道的自然弱毒株和構(gòu)建的基因缺失株當(dāng)中，研究較多的是MGF和CD2v基因缺失株。本研究利用國內(nèi)報(bào)道的第1起疫情的病毒分離株SY18株首先構(gòu)建了MGF、CD2v單基因缺失和二者的雙基因缺失共3株重組病毒。動物安全性和免疫效果試驗(yàn)證明，MGF基因單缺失和MGF、CD2v雙基因缺失毒株對免疫豬既具良好的安全性又呈現(xiàn)很好的攻毒保護(hù)效果，現(xiàn)將相關(guān)研究結(jié)果報(bào)告如下：

首先構(gòu)建同源重組用質(zhì)粒。從ASFV流行株SY18株基因組中擴(kuò)增獲得CD2v和MGF基因側(cè)翼各1200bp序列作為同源重組質(zhì)粒同源臂。CD2v兩側(cè)翼片段間克隆有綠色熒光蛋白(enhanced green fluorescent protein， EGFP)基因，MGF兩側(cè)翼片段中克隆紅色熒光蛋白(red fluorescent protein，RFP)基因表達(dá)框。

之后進(jìn)行重組病毒拯救和純化。將二者的同源重組質(zhì)粒(2μg)分別轉(zhuǎn)染6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中的豬的原代肺泡巨噬細(xì)胞培養(yǎng)物(細(xì)胞數(shù)約為106個(gè))，4h后感染SY18株(1 MOI)，48h后挑取熒光細(xì)胞(含有重組病毒)，經(jīng)3輪有限稀釋法純化篩選，分別獲得了ASFV SY18△CD2v、ASFV SY18△MGF和ASFV SY18△MGF/△CD2v共3株基因缺失病毒。對拯救的重組病毒進(jìn)行PCR鑒定和序列分析以及純凈性檢驗(yàn)，證明我們成功獲得了CD2v和MGF單基因缺失毒株(ASFV SY18△CD2v和ASFV SY18△MGF)及二者雙基因缺失毒株(ASFV SY18△MGF/△CD2v)。病毒的總體構(gòu)建策略如圖1所示。

圖1 ASFV 基因缺失病毒構(gòu)建策略圖

最后開展了重組病毒特性研究。共用35只健康豬，均分為7組，分別接種3株病毒的2種接毒劑量，具體接種方案如表1。

表1 生物安全評價(jià)接種方案

記錄7組豬的體溫和臨床表現(xiàn)，并對免疫豬血液、糞、唾液進(jìn)行ASFV核酸PCR檢測。結(jié)果表明：

1.組1和組2中豬接種ASFV SY18△CD2v毒株后次日起體溫出現(xiàn)升高，高達(dá)42°C以上，3~5 d內(nèi)全部死亡。說明CD2v單基因缺失沒有明顯致弱病毒毒力。這和國外文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果不一致。

2.組3中豬接種103 TCID50的ASFV SY18△MGF后，次日開始有的豬出現(xiàn)體溫升高，持續(xù)1~3 d，但均未超過41.3C ，隨后恢復(fù)正常，后期未見體溫異常，觀察期精神狀態(tài)正常，采食量未見異常;組4中豬接種104 TCID50的ASFV SY18△MGF后次日有的豬出現(xiàn)體溫升高，體溫范圍在40.2~41.3C之間，持續(xù)8~13日不等，隨后恢復(fù)正常，未見精神沉郁或采食量減少等臨床癥表現(xiàn)。

3.組5、6中豬以103TCID50 和104TCID50劑量接種ASFV SY18△MGF/ △CD2v后，只出現(xiàn)1~2d內(nèi)體溫升高，體溫均在40.5C以下，隨后體溫恢復(fù)正常，采食量和精神狀態(tài)均未見異常。說明，MGF基因缺失可顯著降低ASFV毒力，與國外有關(guān)研究結(jié)果一致;在MGF基因缺失基礎(chǔ)上進(jìn)一步缺失CD2v基因，可明顯降低單純?nèi)笔GF基因的ASFV所引起的較長時(shí)間的發(fā)熱反應(yīng)，安全性進(jìn)一步提高。對觀察期內(nèi)采集的血液、糞、唾液進(jìn)行的ASFV核酸檢測結(jié)果表明，在血液、唾液中可偶爾檢測到病毒核酸，糞便中檢測結(jié)果陰性。

對組3、5、6中的5頭豬在免疫后28d，連同組7中5頭攻毒對照豬，以ASFV SY18強(qiáng)毒株進(jìn)行攻毒試驗(yàn)，攻毒方式為口服，攻毒劑量為103 TCID50，觀察35日。結(jié)果，組3.5.6中免疫豬均獲得完全保護(hù)，在觀察期內(nèi)檢測體溫均在正常范圍內(nèi)，未見任何異常臨床表現(xiàn)。對照組5只豬全部發(fā)病，42℃以上高燒持續(xù)2~7 d后全部死亡。結(jié)果說明，ASFV SY18△MGF/△CD2v不僅具有很好的安全性，而且具有良好的攻毒保護(hù)效果，可作為良好的ASF預(yù)防疫苗候選株。

ASF屬于OIE規(guī)定的必須通報(bào)的動物傳染病，我國將其歸類為一類傳染病。在目前控制ASF傳染源、切斷傳播途徑、保護(hù)易感動物等生物安全措施均不能完全奏效情況下，研發(fā)安全有效的疫苗，保障生豬供應(yīng)是我國生豬養(yǎng)殖刻不容緩亟需解決的問題。盡管疫苗的使用有可能縱容傳染源的存在、放松傳播途徑的切斷，甚至在很大程度上給ASF根除帶來嚴(yán)重挑戰(zhàn)，但從保障國內(nèi)生豬供應(yīng)和解決國計(jì)民生角度考慮，在可控范圍內(nèi)使用疫苗可能是目前在缺乏有效手段阻止ASF傳播情況下無奈且唯一有效的選擇。

本研究采用基因工程方法構(gòu)建了缺失ASFV 毒力基因的缺失株，對其在動物體內(nèi)的免疫效果和安全性進(jìn)行了初步評價(jià)，顯示免疫M(jìn)GF單基因和MGF、CD2v雙基因缺失的豬對ASFV強(qiáng)毒攻擊具有完全的保護(hù)作用，說明其可作為我國非洲豬瘟疫苗候選株，值得進(jìn)一步研究和探索。目前全球范圍內(nèi)，很多學(xué)者對非洲豬瘟疫苗的研發(fā)持懷疑甚至反對態(tài)度，這主要是因?yàn)锳SFV不能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體，在豬體產(chǎn)生免疫保護(hù)的情況下，強(qiáng)毒依然可感染并產(chǎn)生病毒血癥。研究證實(shí)，ASFV自然弱毒株在試驗(yàn)豬可造成嚴(yán)重的副作用，更有可能出現(xiàn)新的變異和新的流行。因此使用疫苗對于消除非洲豬瘟確實(shí)是不利的。進(jìn)一步提高疫苗候選株的安全性和擴(kuò)大疫苗效力的評價(jià)范圍以及更為長期的生物安全評價(jià)對于非洲豬瘟疫苗而言是十分必要的。

已經(jīng)報(bào)道的ASFV毒力相關(guān)基因有多種，本研究只選擇了目前國際上報(bào)道較多的MGF和CD2v基因作為缺失對象。我們的結(jié)果顯示，CD2v基因單獨(dú)缺失對病毒毒力影響有限，而MGF基因(含3個(gè)MGF505基因和3個(gè)MGF360基因)缺失后，高劑量免疫后盡管會引起較長時(shí)間的體溫升高，但是不影響機(jī)體的精神狀態(tài)和采食量。在低劑量免疫時(shí)，導(dǎo)致機(jī)體長時(shí)間發(fā)熱的現(xiàn)象消失。在MGF缺失基礎(chǔ)上進(jìn)一步缺失CD2v基因后，病毒接種引起的長時(shí)間發(fā)熱現(xiàn)象基本消除，說明盡管CD2v單基因缺失株毒力很強(qiáng)，但CD2v基因缺失能夠進(jìn)一步降低MGF缺失株的毒力。

盡管我們構(gòu)建的ASFV雙基因缺失疫苗具有很好的安全性和免疫保護(hù)效果，但由于ASFV結(jié)構(gòu)復(fù)雜，病毒感染和免疫機(jī)制尚未完全明確，且ASFV產(chǎn)生的抗體不具中和活性，因此ASFV SY18△MGF/△CD2v長期使用的安全性及免疫持續(xù)期有待進(jìn)一步評價(jià)。從安全性的角度考慮，研究ASFV亞單位疫苗、病毒載體疫苗等也將是未來非洲豬瘟疫苗研究的重要方向。 來源：中國獸醫(yī)學(xué)報(bào)